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SPA夾心ELISA試驗(yàn)檢測CIC
更新時(shí)間:2011-11-02   點(diǎn)擊次數(shù):1310次

金葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)可與IC中IgG的Fc段結(jié)合。將待測血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上,再以酶標(biāo)記的SPA與之反應(yīng),即可檢測樣本中有無IC。

(一)試劑
1.5%與2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制。
2.牛血清白蛋白(BSA)緩沖液:用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞,0.05%Tween 20,4%BSA。
3.HRP—SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶(HRP)制成結(jié)合物。zui適工作濃度以方陣法滴定。
4.熱聚合人IgG:人IgG 10mg/mL,63℃加熱20min制成。

(二)操作步驟
1.用PBS稀釋SPA成5Ps/mL,包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔,每孔0.1mL(對照孔不包被),置4℃過夜后洗滌3次備用。
2.待測血清0.05mL加PBS0.15mL和5%PEG0.2mL混勻,4℃過夜后1 600r/min離心20min,棄上清,沉淀用2.5%PEG洗2次,加入PBS0.2mL和BSA緩沖液0。2mL,混勻,置37℃水浴30min,搖動(dòng),使*溶解。
3.將已溶解的待測血清沉淀物加至上述包被孔和對照孔中,置37℃ 60min,洗3次;各孔加底物溶液(OPD—H202)0.1mL,37C 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴終止反應(yīng)。置酶標(biāo)儀492nm測各孔吸光值。
4.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取正常人血清0.2mL,加熱聚合人IsC(120ug/mL)0.2mL,再加PBS0.4mL和5%PEG0.8mL,置4℃過夜。同時(shí)做不加熱聚合人耽的正常血清對照,以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標(biāo)本操作。用稀釋的BSA緩沖液(加等量0.01 mol/LpH7.4PBS)1.6mL溶解并稀釋成120、60、30、15、7.5ug/mL,與待測血清同法操作,制成工作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.結(jié)果判斷 從待測血清吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可換算成相當(dāng)于熱聚合人IgG的CIC含量(ug/ml)。以高于正常對照X+2S,即大于28.4ug/mL為陽性。

(三)注意事項(xiàng)
1.熱聚合人IgC應(yīng)分裝貯存于—20℃,不宜反復(fù)凍融,否則易解聚。
2.PEG的濃度影響CIC沉淀量,須嚴(yán)格配制。
 

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